Titulo Estágio
Rastreamento do tráfego intracelular de nanopartículas lipídicas usando Microscopia confocal Raman
Local do Estágio
Faculdade de Medicina, Polo 1, 3004-504 Coimbra / Polo 3, Azinhaga Santa Comba, Celas, 3000-548
Enquadramento
Os avanços recentes em nanotecnologia, incluindo o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas (LNPs) com mRNA encapsulado, foram cruciais para inovações médicas como a vacina contra a doença por coronavírus 2019 (COVID-19). Além de facilitarem a entrega, as LNP atuam como um escudo protetor das moléculas de mRNA, preservando a sua integridade e estabilidade até estas atingirem o destino pretendido. No entanto, o sucesso e a segurança destes sistemas de entrega dependem em grande parte do seu tráfico intracelular. Compreender esse processo é crucial para explorar o potencial das LNPs em novas aplicações médicas, como o tratamento de tumores sólidos extra-hepáticos.
A monitorização da internalização e transporte das LNPs em tempo real sem alterar a fisiologia das células e as propriedades físicas das nanopartículas é um desafio devido ao ambiente celular complexo e à escala das LNPs. Neste aspeto, a Microscopia Raman Confocal (CRM) acoplada a técnicas computacionais avançadas oferecem uma solução promissora.
A CRM alia a espetroscopia Raman à microscopia confocal, permitindo obter imagens de células vivas com sensibilidade, especificidade e baixo custo. Recorrendo a técnicas computacionais avançadas, como algoritmos de Machine Learning, é possível decifrar as assinaturas Raman complexas. Esta metodologia pode aprofundar a nossa compreensão do tráfico celular de LNP, possivelmente desbloqueando novas e inovadoras vias para futuras terapias.
Objetivo
O objetivo deste trabalho é desenvolver métodos de análise para a separação de dados espectrais em imagens CRM, ou seja, isolar assinaturas moleculares específicas. Em imagens CRM obtidas a partir de células incubadas com LNPs, cada pixel representa o espectro das biomoléculas celulares, bem como as assinaturas Raman das LNPs, que frequentemente se sobrepõem. A interpretação precisa destes dados espectrais exige a separação adequada dos sinais, de modo a distinguir as contribuições de cada molécula e compreender a interação entre as LNPs e as células alvo.
Iremos aplicar técnicas de aprendizagem automática para reconhecer assinaturas específicas e distinguir vibrações Raman. Na microscopia confocal Raman, é possível scanear ponto a ponto um plano 2D para obter uma imagem da amostra. A aquisição in vivo implica limitar ao mínimo o tempo de integração (ou tempo de aquisição), o que significa que são recolhidos menos fotões, resultando num menor rácio sinal-ruído (SNR). A utilização de deep learning, em particular redes neuronais de convolução (CNNs), módulos de atenção e vision transformers (ViT), irá permitir o reconhecimento de características espetrais Raman locais (picos Raman) mesmo em situações com baixo SNR. Estas redes podem ser treinadas em bibliotecas Raman, contendo espectro curados sobre diversos tempos de integração, permitindo a classificação dos componentes das células, e, possivelmente, a estimativa das concentrações.
Os algoritmos criados permitirão obter informação pormenorizada sobre a dinâmica da absorção celular das LNP e o seu percurso no interior da célula, crucial para o avanço das formulações de LNP.
Plano de Trabalhos - Semestre 1
Durante o 1º semestre deverão o foco será colocado na aquisição de competências teóricas e práticas sobre a Microscopia Confocal Raman e na análise de métodos existentes de separação espectral.
Tarefa 1 – Revisão da literatura
• Perceber os princípios e aplicações da Microscopia Confocal Raman
• Compreender a importância das propriedades das LNPs e o seu papel na entrega de mRNA
• Fazer um levantamento das metodologias atuais para a separação espectral de dados Raman
Tarefa 2 – Implementação e teste de metodologias existentes:
• Implementar e testar as metodologias existentes para a separação espetral (MCR-ALS, NMF, PCA, ICA, etc.)
• Avaliar o desempenho das metodologias implementadas em dados Raman open source e na biblioteca de sinais Raman construída pelo grupo.
Plano de Trabalhos - Semestre 2
O 2.º semestre será dedicado ao desenvolvimento de novos algoritmos baseados em deep learning, com especial atenção à separação espectral e ao rastreamento de nanopartículas lipídicas (LNPs) utilizadas em sistemas de entrega de mRNA.
Tarefa 3 – Desenvolvimento de algoritmos de deep learning para a separação espetral:
• Desenvolver e implementar abordagens baseadas em deep learning para separação espetral (CNNs com atenção, ViTs). Comparar o seu desempenho com os métodos existentes.
• Elaborar metodologias para o rastreamento das LNPs no tempo.
• Desenvolver bibliotecas e interfaces para facilitar o processamento.
Tarefa 4 – Análise dos resultados e elaboração da tese
Condições
O candidato terá acesso a computadores de elevado desempenho, equipados com placas gráficas dedicadas (ex: NVIDIA RTX 3090), adequados para tarefas intensivas como treino de modelos de machine learning. Adicionalmente, se necessário, poderá recorrer a recursos computacionais complementares presentes na Universidade.
Observações
Este projeto de mestrado está alinhado com o projeto LNPtrace, recentemente aprovado pela FCT: Tracing Lipid Nanoparticle-Mediated mRNA Delivery in Live Tumor Cells by Raman Confocal Imaging (2023.11762.PEX; https://cnc.uc.pt/en/rd-projects/lnptrace-monitorizacao-da-entrega-de-mrna-mediada-por-nanoparticulas-lipidicas-em-celulas-tumorais-por-imagiologia-confocal-raman) e engloba uma bolsa paga.
O projeto será coorientado pelo Professor Pedro Guimarães, professor na Faculdade de Medicina para a área de Ciência de Dados e Inteligência Artificial (https://orcid.org/0000-0002-9465-4413).
O aluno participará também em reuniões regulares com os elementos da equipa, que prestarão apoio em diferentes aspetos do projeto, contribuindo assim para o seu sucesso.
Orientador
Ana Batista
ana.batista@uc.pt 📩